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Metodica - Methods
Gli addetti ai lavori di tutta Europa concordano che, fra
tutti gli accumulatori biologici destinati al monitoraggio degli elementi in
traccia nelle acque superficiali, i migliori requisiti sono offerti dalle
briofite, ossia muschi ed epatiche. Queste piante sono sedentarie, ubiquitarie
ed abbondanti, e presentano ciclo vitale lungo, taglia e consistenza adatte al
campionamento durante tutto l’anno, fattore di bioconcentrazione molto elevato
(dell’ordine di 10^3 - 10^5) e correlato in maniera semplice alla concentrazione
in acqua nella sola forma biodisponibile, resistenza a concentrazioni elevate di
sostanze tossiche tanto da essere utilizzabili anche in esperienze di
laboratorio.
Il principio chimico che rende le briofite eccezionali
accumulatori di elementi in traccia si basa sull’abbondanza di gruppi chimici
carichi negativamente sulla parete cellulare, che agiscono come siti di scambio
per i cationi disciolti in acqua. Giacché queste piante sono sprovviste di
sistemi vascolari di conduzione, prelevano i nutrienti dal mezzo acquoso per
assorbimento attraverso tutta la superficie del tallo. Questi siti di scambio
non sono né quantitativamente né qualitativamente selettivi, perciò non
distinguono elementi essenziali da elementi tossici, verso cui le briofite sono
estremamente resistenti.
L’accumulo avviene prima mediante adsorbimento, un fenomeno rapido, passivo ed in buona parte reversibile di adesione che si verifica sulla superficie esterna della parete cellulare. Dopo un periodo variabile da qualche ora a qualche giorno vengono attivati sistemi di trasporto attivo, absorbimento, che portano gli elementi all’interno della cellula: gli elementi così immagazzinati sono scarsamente mobilizzabili e determinano un effetto memoria.
Poiché in natura la concentrazione degli elementi in acqua e la loro biodisponibilità possono fluttuare enormemente, fra pianta ed acqua si instaura un equilibrio dinamico che oscilla tra fasi di accumulo e di rilascio. Nel momento in cui l’operatore preleva la pianta, interviene in corrispondenza di una di queste fasi, necessariamente sconosciuta, ricavando non tanto una misura oggettiva, bensì un’indicazione della contaminazione.
L’utilizzo pionieristico delle briofite acquatiche per il monitoraggio degli elementi in traccia è stato inaugurato nei primi anni ’70 del XX secolo in Belgio, Gran Bretagna e Francia e ad oggi si contano numerosissimi lavori di caratterizzazione di fiumi e torrenti, ma anche studi sulla fisiologia dell’accumulo.
Le briofite raccolte nelle campagne di biomonitoraggio
possono essere destinate direttamente all’analisi chimica, oppure conservate
allo scopo di allestire banche di campioni ambientali (Environmental Specimen
Banks): collezioni di campioni che consentano l’analisi retrospettiva di
sostanze nocive e dei loro effetti su matrici ambientali o popolazioni. Un
esempio brillante si è avuto in Galizia mediante l’utilizzo dei muschi
Platyhypnidium (=Rhynchostegium) riparioides e Fontinalis spp.
Qualora non esistano briofite autoctone nel sito di studio
o si voglia riferire ad un tempo certo l’episodio di contaminazione, le piante
possono essere facilmente trasferite da una sorgente di riferimento al luogo
d’intervento mediante appositi supporti chiamati moss bags. I vantaggi
offerti da questa tecnica sono: copertura a piacere dell’area di studio, maggior
capacità di accumulo, dati direttamente confrontabili grazie all’impiego di una
sola specie. La tecnica dei moss bags è stata utilizzata con successo in
diversi Paesi del mondo per monitoraggi ambientali su ampia scala ed indagini su
specifiche fonti d’inquinamento.
I ciuffi di muschio vengono solitamente prelevati da una
sorgente non contaminata, dove flusso e livello dell'acqua garantiscono una
totale immersione delle piante durante tutto l'anno. Il materiale viene quindi
omogeneizzato grossolanamente per smembramento e risciacquato per eliminare
materia organica, melma, sabbia ed organismi epifiti. 20-30 g di materiale umido
sono sufficienti a realizzare un moss bag, fabbricato con della rete di
plastica richiusa ad astuccio. Uno o più bags sono infine
collocati nel sito di studio mediante un'apposita stazione. Il tempo
d'esposizione varia a seconda degli scopi dello studio ed è generalmente
compreso fra qualche giorno e 4-8 settimane.
Al termine dell'esposizione, il contenuto di ogni moss
bag viene trasportato in laboratorio e risciacquato per qualche secondo
sotto un getto di acqua demineralizzata per rimuovere lo sporco ed i
contaminanti non fissati alle pareti cellulari. Le parti apicali del muschio
vengono selezionate ed asportate, essiccate per almeno 2 giorni a 40 °C e quindi
mineralizzate attraverso una digestione acida. Le concentrazioni di elementi in
traccia sono determinate mediante spettrofotometria in assorbimento atomico. I
risultati sono confrontati con i valori di riferimento per ogni elemento allo
scopo di calcolare il fattore di contaminazione e di quantificare il livello di
alterazione ambientale.
European experts agree in considering bryophytes (mosses and liverworts) the best accumulators for trace element assessment in freshwaters, since these organisms are sedentary and abundant the world over. Moreover, they have a long life-cycle, size allowing their collection all year round, high bioaccumulation factors (10^3 - 10^5), almost exclusively correlated to the concentrations of bioavailable forms in the waters they inhabit, resistance to high concentrations of toxic elements, both in the field and under laboratory conditions.
Bryophytes are exceptional accumulators because of the high density of ionic exchange sites on their cell walls, which supply the plant with micro-nutrients directly from the water through its surface, since there is no vascular system of conduction. These exchange sites are neither quantitatively nor qualitatively selective, and are thus unable to distinguish between essential and toxic elements, to which bryophytes are strongly resistant.
Accumulation is a two-phase phenomenon: first, a rapid, passive and mostly reversible adsorption occurs on the external surface of the cell wall. Then, after hours or days, active transport mechanisms start the absorption through the cell membrane: elements stored within the cell are slightly exchangeable, so they grant a time-lasting memory effect.
Since trace element concentration in water and their bioavailability could rapidly change, a dynamic equilibrium between environment and plant is established, with uptake and release phases. When a plant is sampled, measured concentrations are the result of one of these phases, although which one, is unknown, so we obtain an indication, rather than a measure of the pollution event.
During the 1970s the first surveys based on bryophyte samples were carried out in Belgium, Great Britain and France. Today, scientific literature counts numerous papers on the chemical characterization of watercourses by bryophytes, the study of accumulation physiology, etc.
Bryophytes sampled during biomonitoring actions may be immediately analysed, or stored in Environmental Specimen Banks: collections of samples, representative of biological specimens, stored for future analysis. The aquatic mosses Platyhypnidium (=Rhynchostegium) riparioides e Fontinalis spp. are successfully used in Galicia (Spain) for this purpose.
In the absence of native plants, mosses and liverworts may be easily transferred from a clean site to the survey area inside bags: one can thus establish when a pollution event has occurred, use the preferred sampling density and obtain comparable results, since the same species may be used throughout the study area. Furthermore, transplants have higher accumulation rates than autochthonous plants. The moss bag technique has been successfully adopted in several countries, both for widespread monitoring plans and investigations on specific pollution sources.
Submerged moss tufts are collected from an uncontaminated spring where water is always running and deep enough to ensure a total immersion all year round. Moss branches are rinsed to remove organic particles, mud and sand, then they are homogenised. Moss bags containing 20-30 g of moist material are made of a plastic net (fig. 1). An aliquot is preserved to determine pre-exposure concentrations. One or more bags are placed at each biomonitoring station (fig. 2). The exposure time is selected according to the aims of the study: it generally ranges from few days to 4-8 weeks.
After exposure, mosses are transported to the laboratory and rinsed for a few seconds in bi-distilled water to remove contaminants non fixed to the cell wall. Apical shoots are selected, dried for 2 days at 40 °C, weighed (100-500 mg) and mineralised through acid digestion. Trace element concentrations are determined by atomic absorption spectrophotometry. Results are compared to the reference concentrations for each element to calculate the contamination factor and to quantify environmental alteration.